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Beiträge von der DETECTA 2004, 10.-11. Juni 2004:
Zweidimensionale Chromatographie: Trennleistung, Effizient, Automatisierung
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Koni Grob |
Inhaltsverzeichnis
Einleitung
Mehrdimensionale Trenntechniken werden schon lange eingesetzt, denn praktisch jede Vortrennung (Extraktion, SPE etc.) macht eine Trennung mehrdimensional. Unterschiedlich ist allerdings die Effizienz gemessen an Trennleistung, Selektivität, Material- und Zeitaufwand und Probenintegrität. Es besteht grosses Interesse, möglichst wenige, dafür hoch wirksame Trennschritte einzusetzen.
Höhere Trennleistung und tiefere Nachweisgrenzen können durch selektivere Detektion (MS oder MS/MS) erreicht werden. Wenn diese Möglichkeiten ausgeschöpft sind, kann die chromatographische Trennung noch wesentlich verbessert werden, indem die Effizienz der ersten Trennung erhöht wird, d.h. durch zweidimensionale Chromatographie.
GC-GC-Kopplung
Die zweidimensionale GC, basierend auf der Nachtrennung einer oder mehrerer Fraktionen aus einer ersten Trennung auf einer zweiten Trennsäule anderer Selektivität, hat manche anspruchsvolle Aufgabe gelöst, z.B. die Isolierung und Trennung enantiomerer Geruchs- oder Aromakomponenten.
Interessant
ist aber auch die umfassende GC x GC, bei der das Eluat einer ersten
Trennung in kleinen Fraktionen auf einer kurzen, engen zweiten
Trennsäule ein zweites Mal aufgelöst wird. Dabei wird
eine enorme Trennleistung möglich, aber auch eine
systematische Anordnung der Probenkomponenten im zweidimensionalen
Chromatogramm (Contour plot), welche Verbindungen ähnlicher
Natur gruppiert und als solche erkennen lässt.
Im Gegensatz zur LC-GC setzt GC x GC voraus, dass alle Verbindungen in
ähnlicher Konzentration vorliegen (beschränkter
dynamischer Bereich der GC).
Inhaltsverzeichnis
- Zweidimensionale GC: "Heart cutting"
- Umfassende ("comprehensive") zweidimensionale GC-Trennung: GCxGC
Zweidimensionale GC: "Heart cutting"
- Technik
aus den 1970er Jahren
- "Heart
cutting": Selektiver Transfer der Fraktionen oder Peaks von Interesse
auf eine zweite Säule mit verschiedener Selektivität
- Mit den heutigen "Press-fit"-Verbindungen leicht aufzubauen
Schema GC-GC-Kopplung
Abb.: Stefan Reimann, Chloressigsäuren in Hydrospäre
und Biosphäre, Tübingen, 1996
Beispiel 1: Chirale Trennung
-
Diastereomere Menthole als Urethan-Derivate
- Erste Säule: OV-1701
- "Cold trapping" mit CO2
- Zweite Säule: Dipeptid
Abb.: Schomburg et al., HRC 7, 404 (1984)
Beispiel 2: Chloressigsäuren in Regenwasser
Abb.: Chromatogramm Chloressigsäuren als Propylester: DCPA, Dichlorpropionsäure; DCA, Dichloressigsäure; TCA, Trichloressigsäure; MCA Monochloressigsäure
Umfassende ("comprehensive") 2-dimensionale GC-Trennung: GC x GC
- Die
Technik ist etwa 13 Jahre alt
- Das von
einer ersten Säule eluierte Material wird in Portionen von 4-6
s aufgestaut und während den nachfolgenden 4-6 s auf einer
zweiten Säule chromatographiert.
- Eine ziemlich lange erste Säule (z.B. 30 m x 0.25 mm I.D.) gekoppelt mit
- einer
schnellen zweiten GC-Säule (1-2 m x 0.1-0.2 mm I.D.)
- Ein
"Modulator" stoppt das von der ersten Säule eluierte Material
und konzentriert es zu einem scharfen Band am Anfang der zweiten
Säule.
Abb. Schematische Darstellung der Orthogonalität der GCxGC:
J. B. Philips, J. Beens, J. Chromatogr. A 856 (1999) 331-347
Vorteile der GCxGC
- Spektakulär erhöhte
Trennleistung: Die
Peak-Kapazität vergrössert sich um einen Faktor von
3-8
- Chemisch ähnliche
Verbindungen werden gruppiert
- Hilft, die Zusammensetzung der Probe darzustellen
- Kann
die Identifizierung von Komponenten mit GC-MS ersetzen
- Erhöhte Empfindlichkeit
"Cryojet Modulation"
Abb.: Gorecki et al., JSS 27 (2004) 359
Abb.: J. Dallüge et al., J. Chromatogr. 1000 (2003) 69-108
Modulation erhöht die
Empfindlichkeit
Abb.: Gorecki et al, JSS 27 (2004) 359
Darstellung der Daten
Die aneinander gereihten Chromatogramme der 2. Dimension werden auseinander geschnitten, gedreht und nebeneinander gelegt. Der Contour plot bildet die Peaks quasi von oben ab.
Beispiel:
Phenol-Harze für die Beschichtung von Dosen
Addition von
Formaldehyd an die Phenole, Butylierung, Hemiacetale mit Formaldehyd,
Kondensation über die Methylole 
>1000 Komponenten
GC-MS eines Phenol-Harzes: auf Phenol aufgebautes Resol
GCxGC-FID des gleichen Phenolharzes
Stand der Technik
- Einfach
einzuführen und schnell erlernbar
- Geeignete
Software ist erhältlich
- Kein
wirklich befriedigender Modulator: Kryofokussierung mit CO2
verbraucht eine Flasche pro Tag! Deshalb nicht für
Routine-Analyse geeignet.
- Teures MS: TOF
LC-LC-Kopplung
LC-LC Kopplungen werden wenig benützt, obwohl wegen der mässigen Trennleistung der LC eine Nachtrennung oft wünschbar wäre. Grundlegend verschiedene Trennung kann allerdings nur bei Kopplung unterschiedlicher LC-Techniken erwartet werden, z.B. NPLC mit RPLC, was oft zu Schwierigkeiten wegen Phaseninkompatibilitäten führt. Erste Versuche von umfassender ("comprehensive") LCxLC basierten auf der Kopplung einer ersten, kleinen Trennsäule mit einer grossen zweiten, damit das Fraktionsvolumen für die zweite Trennsäule gering bleibt. Die mobile Phase der ersten Stufe könnte allerdings auch mittels "On-line"-Verdampfer entfernt werden.
Inhaltsverzeichnis
- Säulen für die LC-LC
- Transfer via Loop
- LC-LC "Heart cutting"
- Umfassende ("comprehensive") zweidimensionale LC-Trennung (LCxLC)
Säulen für die LC-LC
- Säulen mit verschiedener
Selektivität
- Die
Säule mit der stärkeren Retention als zweite
Säule - die Startbande wird am Anfang der zweiten
Säule wieder aufkonzentriert
- Schwieriger Transfer
NPLC-RPLC oder RPLC-NPLC
- "Backflushing" der ersten Säule spart Zeit
Transfer via Loop
Transfer via Loop, um den druckempfindlichen Fluoreszenzdetektor zu
schützen
LC-LC "Heart cutting"
Abb.: Säulenschaltung
Beispiel: Kontrolle von ölhaltigen Lebensmitteln
Bisphenol-A-diglycidyl-ether (BADGE) aus Epoxy- oder Organosol-Beschichtungen von Konservendosen
BADGE
- Direkte
Einspritzung des Öl- oder Fettextrakts auf die
NPLC-Säule,
- Fluoreszenz-Detektion
Umfassende ("comprehensive") zweidimensionale LC-Trennung (LCxLC)
Ernsthafte Probleme:
- Schnelle
Trennung in der 2. Dimension: kleine Partikel, sehr hoher Druck
- Inkompatibilität der mobilen Phase
Beispiel:
Dugo/Mondello, Riva 2004:
- 30 cm x 1 mm i.d. Silica Säule, 20 µl/Min.
Ethylacetat/Hexan
- 2.5 cm x 4.6 mm i.d. RPLC, AN/Wasser, 4 ml/Min.
- Transfer via Loop, 1 Min. Zyklen, 60 Min. totale Laufzeit
- 20 µl von NPLC-Eluent auf RPLC-Säule
LC-GC-Kopplung
LC-Vortrennung für die GC
Die Kopplung von HPLC (LC) mit GC kombiniert zwei stark unterschiedliche Trennprinzipien, wobei die LC häufig eine weniger effiziente Vortrennung mittels flüssig/flüssig-Verteilung, SPE oder Säulenchromatographie ersetzt. HPLC weist eine viel höhere Trennleistung auf, und die interessierende Fraktion kann mittels on-line Detektion scharf eingegrenzt werden, d.h. die Probe wird sehr viel besser gereinigt oder es gelingt, ähnliche Substanzklassen vorzutrennen. Der Nachteil der mässigen Kapazität kann dadurch wettgemacht werden, dass das gesamte Material der Fraktion in die GC übertragen wird, also nur eine relativ geringe Menge in die HPLC eingespritzt werden muss. LC-GC kann on-line oder off-line erfolgen, je mit spezifischen Vorteilen.
Inhaltsverzeichnis
- High performance Ersatz für SPE
- HPLC als Vortrennung für die GC
- Off-line LC-GC
- On-line LC-GC
- Umfassende ("comprehensive") LCxGC
High performance Ersatz für SPE
- Hohe
Trennleistung
- Scharfe
Trennung der Fraktionen durch Kontrolle mittels Detektor
- Einfache Automatisierung
Verglichen mit GC-GC:
- Hohe
Kapazität der LC (Entfernung von Komponenten, die in 1000 mal
grösseren Mengen vorliegen als die zu trennenden Verbindungen)
- Die Selektivität ist sehr verschieden von der GC (Orthogonalität)
HPLC als Vortrennung für die GC
Normalphase (NPLC):
- Lösungsmittel-Kompatibilität
(Pentan mit "Modifiern")
- GC
sowieso nicht für hochpolare Substanzen geeignet
- auch für derivatisierte Proben
"Size exclusion"-Chromatographie (SEC)
Beispiel: Vortrennung mit Normalphasen-HPLC (NPLC)
Extrakt aus
der Beschichtung von Dosen mit Simulans für fettige
Lebensmittel
- NPLC Gradienten-Elution
- Fluoreszenz-Detektion bei zwei verschiedenen Abschwächungen
Off-line LC-GC
-
Beschichtete 0.50 cm x 0.53 mm i.d. Vorsäule
- Simultane Verdampfung in einem "on-column"-Injektor/Interface
- Injektion/Transfer mit 1-5 µl/s
- Flussrate durch SVE ("Solvent Vapour Exit"), 100-400 ml/min
- Einfache
Technik:
Fraktionen werden am Ausgang des LC-Detektors gesammelt, z.B. in "Autosampler"-Fläschchen
- Hohe
Anpassungsfähigkeit
Einspritzung des grössten Teils der LC-Fraktion möglich, z.B. 100 µl von 200 µl Fraktionen, wie sie normalerweise von einer 2 mm i.d. NPLC-Säule erhalten werden.
- Nur eine
kleine Vorsäule nötig
- Simultane
Lösungsmittelabdampfung
Verlust von flüchtigen Verbindungen (kein "Solvent Trapping");
LV (large
volume) Injection GC-MS
Abb.: GC-MS von NPLC Fraktionen eines Lackmigrats
- Fraktionen
in Autosampler-Fläschchen gesammelt und automatisch mit 1
µl/s injiziert
- 100-200 µl "on-column"-Injektionen
- Simultanes Verdampfen des Lösungsmittels
On-line LC-GC
Vorteile
- Kompletter Transfer von
Fraktionen (daraus ergibt sich Genauigkeit)
- Automatisierung
- Effizienz/hoher Probendurchsatz
- Reproduzierbarkeit
- Geschlossenes System: keine Verunreinigung der Probe
Instrumentierung
On-line LC-LC-UV-GC-FID für die Analyse von Sterenen in Speiseölen
- Erste
Säule: Entfernung des Grossteils der Matrix (Öl),
Verlust an Aktivität wegen des polaren Materials
- Zweite Säule: Hohe Aktivität, d.h. nur Kohlenwasserstoffe, stabiles Verhalten
LC-GC Interface
"Concurrent Evaporation" (simultane Lösungsmittelabdampfung)
- Die
Verdampfung ist so schnell, wie die Zuführung zum GC,
d.h. es gibt keinen Aufstau des Lösungsmittels,
d.h. +/- keine Limitierung der zugeführten Volumina.
- Nur kurze
Vorsäule nötig
- Kein "Solvent trapping", d.h. Verlust von flüchtigen Komponenten
"Retention Gap" Technik
- Höchstens ein Teil des
Lösungsmittels verdampft
während der Zuführung (Transfer oder Einspritzung)
- "Solvent
trapping" hält flüchtige Verbindungen zurück
- Benötigt eine lange unbelegte Vorsäule.
"On-column Interface"
Anwendungen:
- "Retention gap"-Technik, Voraussetzung für Solvent trapping
- "Concurrent evaporation"
- Gleiches Interface und gleiche Technik wie für grossvolumige on-column Einspritzung
- Ein einziges Interface für beide Transfertechniken
"Loop Type Interface"
Anwendung: "Concurrent evaporation"
- hochgradig selbstregulierend
- grösste Verbreitung
"Backflushing": Rückspülung der LC-Säule während der GC-Analyse
Beispiel 1: Nachweis der Raffination bei Öl über Sterene
Dehydroxylierte Sterine dienen als Indikatoren für
- Raffination (Unterscheidung
von "kalt gepresst" oder "nativ")
- Verfälschung von Extra Vergine Olivenöl mit raffiniertem Öl
Beispiel 2: Verfälschung von Olivenöl mit Sonnenblumenöl über isomerisiertes Delta-7-Stigmastenol (Delta-8/14-Stigmastenol)
Transmethyliertes Öl, d.h. TG wird zu FAME, hydrolysierte Sterinester.
-
Ungenügende Stabilität der LC-Retentionszeit Steuerung des Transfers
über die Detektion eines früher eluierten Peaks (Peak
detection)
- Stat. Phase: Silicagel
- Mobile Phase: 1% 2-Propanol/Hexan
Delta-8/14-Stigmastenol
In die GC transferierte LC-Fraktion
Hauptproblem: Trennung vom knapp abgetrennten 1-5000 Mal grösseren Sitosterin-Signal
Beispiel: Nachweis der Bestrahlung von Lebensmitteln
Abb.: Abspaltung von Kohlenwasserstoffen aus Triglyceriden (1-10 ppm bezüglich Fett)
LC-GC aller Kohlenwasserstoffe
Beispiel: bestrahltes Schweinefleisch (Speck)
LC-LC Isolierung der Diene
- Zugabe
grosser Mengen von flüchtigen Retentionszeit-Standards zur
Kontrolle des Transfer-Fensters
- Stat. Phase: Silicagel
- Mobile Phase: Hexan
Vergleich
LC-GC mit LC-LC-GC
Beispiel: Bestrahlter Lachs
LC-LC Isolierung von Bestrahlungs-Dienen ist Voraussetzung
Beispiel: Bestrahltes Änis
LC-SE-LC-GC
On-line Lösungsmittelverdampfung ("Solvent evaporator", SE) zwischen zwei LC-Trennschritten
- Reduktion
grossvolumiger Fraktionen von der ersten Säule
- Eliminierung ungeeigneter (starker) Eluenten
On-line Verdampfer
Beispiel: Durch Mineralöl aus Jutesäcken verunreinigter Reis
Umfassende ("comprehensive") LCxGC
Erhältlich seit 1988:
Bezeichnung "GC-Scanning".
- LC-Chromatogramm wird mit
einem GC "gescannt"
- Der Fluss
im LC wird während der GC-Analyse gestoppt
- Braucht
leicht einen ganzen Tag ...
- ... ist aber voll automatisiert
Von Munari, Dugo and Cotroneo (1990) gezeigt, dass es für ätherische Öle funktioniert.