Zurück
zu:
Applica
Beiträge von der DETECTA 2004, 10.-11. Juni 2004:
UV-Detektion in der HPLC: So selbstverständlich wie Pferd und Wagen
 |
Veronika
Meyer, EMPA St. Gallen, Schweiz |
Bruno
E. Lendi, OmniLab Ltd. Mettmenstetten |
Inhaltsverzeichnis
- Warum UV-Detektion?
- Blick zurück: "Diodenarray" vor 100 Jahren
- Physikalische Grundlage: Lambert-Beer
- Fotometrie: Welche Extinktion ist günstig?
- Wie gross darf die Bandbreite sein?
- Streulicht
- Lichtquellen
- Monochromatoren
- Zelle
- Lichtempfindliches Element
- lin-log-Konversion
- Messbereiche
- Heute: Eine Zelle
- Was müssen Sie noch tun?
- Sie möchten einen neuen Detektor?
- Literatur
Warum UV-Detektion?
- Weil viele Moleküle im UV absorbieren und viele Lösungsmittel im UV transparent sind
- Weil das Messprinzip einfach ist
Abb. 1: Messprizip der UV-Detektion
Blick zurück: "Diodenarray" vor 100 Jahren
Abb. 2: Messprinzip vor 100 Jahren
Abb. 3: Spektrum
von Chlorophyll b
Willstätter, Stoll & Utzinger, Justus Liebig's Annalen
der Chemie, 385 (1911) 156
Physikalische Grundlage: Lambert-Beer
Abb. 4: Transmission
|
Transmission: T = I / I0
= 10-εcd T ist
nicht proportional zu Konzentration c, aber A ist es |
A:
Extinktion |
Fotometrie: Welche Extinktion ist günstig?
Abb. 5: günstigste Extinktion
A: Extinktion
RSD(c): Relative Standardabweichung
c: Konzentration
I: Strahlungsintensität
I0: Strahlungsintensität vor Eintritt
in die Probe
sc: Standardabweichung c
sT: Standardabweichung T
T: Transmission
Wie gross darf die Bandbreite sein?
Lambert-Beer
gilt für monochromatisches Licht. Sind 2 Wellenlängen
λ1 und λ2
beteiligt, so sind auch 2 Extinktionskoeffizienten ε1
und ε2 relevant.
(ε1 ≠ ε2,
ausser bei ganz flachem Spektrum):
A nicht proportional zu c!
Aber:
grössere Bandbreite
mehr Energie.
In der Praxis: Kompromiss, Bandbreite ca. 10 nm für HPLC
Streulicht
= Licht der
falschen (unerwünschten) Wellenlänge
und
Licht, das nicht durch die Probe aber auf die Fotodiode fällt
Ursachen:
- Fehler im Gitter.
- Strahlung höherer Ordnung vom Gitter.
- Probe fluoresziert.
Abhilfe: Doppelmonochromator (bei HPLC-Detektoren nicht üblich).
Prozentualer
Fehler durch Streulicht steigt mit zunehmender Extinktion:
Beispiel: 0,1 %
Streulicht (wird durch die Probe nicht
absorbiert)
| A wahr: | 1 (T = 0,1 = 10 %) | 2 (T
= 0,01 = 1 %) |
| Licht auf Fotodiode: | 10,1 % T | 1,1 %
T |
| A scheinbar = log 1/T: | 0,9957 | 1,959 |
| c zu klein: | 99,6 % | 98 % |
Lichtquellen
Fixwellenlänge:
Hg (254 nm), Cd (229 nm), Zn (214 nm)
einfach, billig, eingeschränkte Messmöglichkeit,
veraltet
Kontinuierliche
Spektren:
D2: < 200 nm bis ca. 340 nm (Restlicht
mit wenig Energie bis 600 nm)
W-Halogen: 340 bis 850 nm
| Lebensdauer: | Deuterium |
2000
bis 5000 h. |
| |
Wolfram-Halogen | 800 bis 2000 h |
| |
|
|
| Preis: | Deuterium |
Fr.
700 bis 1200 |
| |
Wolfram-Halogen | Fr. 20 bis 80 |
Monochromatoren
| Prisma: | war
früher billiger als Gitter Nachteil: Dispersion ist λ-abhängig |
| |
|
| Gitter: | grössere Dispersion als
Gitter bessere
λ-Auflösung keine Temperaturabhängigkeit der Dispersion Dispersion ist nicht λ-abhängig mechanische
Konstruktion des
Detektors ist einfacher Nachteile: Streulicht λgewünscht / 2 wird auch reflektiert, (ebenfalls λ / 3, irrelevant wegen O2-Absorption) Problem
wenn mit D2 im VIS gemessen wird λ-Bereich ist kleiner als mit Prisma |
Zelle
Licht wird zwischen Quarzfenster und LM gebrochen, geht teilweise verloren. Weitere Verluste oder Intensitätsschwankungen durch nD-Schwankungen (Gradient, Pulsation, Temperatureffekte, gelöste Analyten)
Abhilfe:
Tapered Cell 
Abb. 6: Tapered Cell, Little & Fallick, J. Chrom. 112 (1975) 389
Weitere Anforderungen
- grosse Länge, A ~ d
- kleines
Volumen: VZelle = Vi / 2
, sonst wird der Peak in der Zelle "verdünnt" und cAnalyt
in Zelle sinkt
Vi: Injektionsvolumen - keine
Turbulenzen erzeugend (
Lichtstreuung)
- gute Ausspülcharakteristik, keine Verschleppung
- kein "Blasenfänger"
- Druckfestigkeit min. 10 bar, besser 100 bar
Lichtempfindliches Element
| Früher: | Fotozelle
oder Fotomultiplier: Hochspannung, Vakuum, grosses Bauteil. |
| |
|
| Heute: | Fotodiode: schneller Response, gute Linearität, wenig Rauschen, wenig Drift, gut passender λ-Bereich, hohe Quantenausbeute, mechanisch robust, klein, billig |
lin-log-Konversion
| Früher: | elektronischer
logarithmischer Verstärker: Probleme: Alterung, Stabilität, periodische Justierung notwendig, A > 2 ist problematisch |
| |
|
| Heute: | rechnerische
Konversion: Rechner sind genügend schnell und leistungsfähig, keine Probleme |
Messbereiche
| UV Min: | Eigenabsorption der
Lösungsmittel Eigenabsorption von O2 ab 195 nm Eigenabsorption von Quarz ab 180 nm |
| |
|
| UV Max: | Leistung der D2-Lampe |
| |
|
| VIS Min: | Leistung der W-Halogen-Lampe |
| |
|
| VIS Max: | Response der Fotodiode
(bis 1100 nm brauchbar), Gittercharakteristik |
| |
|
| effektiv: | UV:
195 bis 340 nm VIS: 340 bis 850 nm |
Heute: Eine Zelle
Referenzstrahl wird mit halbdurchlässigem Spiegel erzeugt
Abb. 7: Vereinfachtes Bauprinzip eines heutigen UV-Detektors für die HPLC
Rauschen
< 1 · 10-5 AU
AU: Absorptionseinheiten
Referenzstrahl kompensiert Intensitätsschwankungen und
Rauschen der Lampe
Fotodioden müssen aufeinander abgestimmt sein
Was müssen Sie noch tun?
Rechtzeitig
Lampe wechseln
Einbau ist narrensicher, Justierung nicht notwendig
Zelle
reinigen:
Mit Wasser bzw. mit Lösungsmitteln, die die Verschmutzung
lösen. Im Extremfall mit halbkonz. HNO3 absorbiert
im UV, nachher stundenlang mit Wasser spülen!
Ev. Zelle auseinander nehmen und Fenster reinigen
Falls Sie
Pech hatten: Zelle
ersetzen
Einbau ist narrensicher, Justierung nicht notwendig
Sie möchten einen neuen Detektor?
Bringen Sie den alten Detektor um:
- Pufferlösung darin stehen lassen
- Mit organischem Lösungsmittel benützen, wenn noch Pufferlösung darin ist
- Endfritte der Säule entfernen
- Ausgangskapillare des Detektors zuquetschen / zuschrauben / verstopfen
Literatur
Bruno E.
Lendi, Veronika R. Meyer
Welchen UV-Detektor für HPLC soll ich
kaufen?
Schweiz. Laboratoriums-Zeitschrift 62 (2005) 8
Bruno E.
Lendi, Veronika R. Meyer
The UV detector for HPLC - An ongoing success story
LC GC Europe 18 (2005) 156
Graham Currell
Analytical Instrumentation -
Performance, Characteristics, and Quality
Wiley, Chichester, 2000
John W.
Dolan, Lloyd R. Snyder
Troubleshooting LC Systems
Humana Press, Totowa, 1989
Veronika R.
Meyer
Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern
Wiley-VCH, Weinheim, 2. Auflage 1999
Donald
Parriott, ed.
A Practical Guide to HPLC Detection
Academic Press, San Diego, 1993
Douglas A.
Skoog, James J. Leary
Instrumentelle Analytik -
Grundlagen, Geräte, Anwendungen
Springer, Berlin, 1996